• Tom Holland vai Peter Parker / Người Nhện[11]: Một thiếu niên và Avenger nhận được khả năng giống như người nhện sau khi bị cắn bởi một con nhện phóng xạ. Bộ phim khám phá những hậu quả sau cảnh mid-credit Người Nhện xa nhà (2019), trong đó danh tính Người Nhện của Peter bị bại lộ. Tom Holland cho biết Peter cảm thấy thất bại, bất an và rất hào hứng khi khám phá khía cạnh đen tối của nhân vật. Việc điều chỉnh trở lại để khắc họa Peter, bao gồm nâng cao cao độ giọng nói của anh ấy và quay trở lại tư duy của một "thiếu niên ngây thơ, quyến rũ", là điều kỳ lạ đối với Holland sau khi đảm nhận những vai trưởng thành hơn như trong Cherry (2021).
  • Tobey Maguire vai Peter Parker / Người Nhện: Một phiên bản khác của Peter Parker. Maguire thể hiện lại vai diễn từ loạt phim Spider-Man của Sam Raimi. Nhân vật này được định danh chính thức trong MCU là Friendly Neighborhood Spider-Man.[12]
  • Andrew Garfield vai Peter Parker / Người Nhện: Một phiên bản khác của Peter Parker. Garfield thể hiện lại vai diễn từ loạt phim The Amazing Spider-Man của Marc Webb. Nhân vật này được định danh chính thức trong MCU là The Amazing Spider-Man.[13]
• Zendaya vai MJ: Bạn cùng lớp và là bạn gái của Peter Parker.[14] Tên đầy đủ của cô là Michelle Jones.[15]
• Benedict Cumberbatch vai Dr. Stephen Strange:
  Một bác sĩ phẫu thuật thần kinh trở thành Bậc thầy về Ma thuật Thần bí sau một vụ tai nạn xe hơi thảm khốc và buộc ông phải kết thúc sự nghiệp. Strange giữ vai trò cố vấn cho Peter thay thế Người Sắt (Robert Downey Jr.) trong Người Nhện: Trở về nhà (2017) và Nick Fury (Samuel L. Jackson) trong Người Nhện: Xa nhà (2019).[16]
• Jacob Batalon vai Ned Leeds: Bạn thân của Peter Parker.[17] Batalon đã giảm 46 kg cho vai diễn trong phim.[18]
• Jon Favreau vai Harold "Happy" Hogan: Cựu giám đốc lực lượng an ninh của tập đoàn Stark Industries, tài xế và vệ sĩ của Tony Stark, đồng thời là người trông nom Peter Parker.
• Jamie Foxx vai Maxwell "Max" Dillon / Electro:
  Một kỹ sư điện từ thực tại khác làm việc cho Oscorp Industries rồi không may biến thành một sinh vật hấp thụ và điều khiển điện năng sau một vụ tai nạn. Foxx quay trở lại với vai diễn của mình trong The Amazing Spider-Man 2 (2014) của Sony. Không giống như bộ phim trước, anh sẽ không còn được khắc hoạ với thân hình màu xanh, mà thay vào đó là màu vàng như trong truyện tranh.[17]
• Willem Dafoe vai Norman Osborn / Green Goblin: Một nhà khoa học và CEO của Oscorp từ một thực tại khác, người thử nghiệm một chất tăng cường sức mạnh không ổn định trên bản thân và phát triển một nhân cách điên rồ thay thế trong khi sử dụng áo giáp và thiết bị Oscorp tiên tiến. Dafoe thể hiện vai diễn của mình trong bộ ba phim Spider-Man của Sam Raimi .
• Alfred Molina vai Otto Octavius / Tiến sỹ Bạch Tuộc: Một nhà khoa học từ thực tại khác với bốn xúc tu thông minh nhân tạo bị hợp nhất với cơ thể sau một vụ tai nạn thí nghiệm. Molina quay trở lại đảm nhận vai diễn của mình trong Spider-Man 2 (2004) của Sony.[19] CGI được sử dụng để bù đắp cho việc ông đã cao tuổi kể từ khi làm bộ phim đó. Các xúc tu cơ học được tạo ra cũng nhờ CGI thay vì thông qua điều khiển rối như trong Spider-Man 2 (2004).
• Tony Revolori vai Eugene "Flash" Thompson: bạn cùng lớp với Peter và từng là người đối đầu với Peter[20]
• Marisa Tomei vai May Parker: Dì của Peter Parker[21]
• Thomas Haden Church vai Flint Marko / Người Cát: Một tên côn đồ đến từ một thực tại khác, người đã nhận được khả năng giống như cát sau một vụ tai nạn. Church đảm nhận vai trò của mình từ Spider-Man 3 (2007).
• Rhys Ifans vai Curt Connors / Thằn Lằn: Một nhà khoa học từ một thực tại khác, người đã cố gắng tạo ra một loại huyết thanh tái tạo để giúp mọc lại các chi và mô người, nhưng bị biến thành một con quái vật bò sát lớn. Ifans đảm nhận vai diễn của mình trong The Amazing Spider-Man (2012) của Marc Webb.

Charlie Cox trở lại vai diễn Matt Murdock, một luật sư mù ở New York, đồng thời là một anh hùng hoạt động với danh xưng Daredevil. Trong khi em trai của Tom Holland là Harry xuất hiện với tư cách khách mời là một tay buôn ma túy,[22] nhưng cảnh của anh đã bị cắt. J. K. Simmonns đóng vai J. Jonah Jameson, chủ tòa soạn TheDailyBugle.net. Tom Hardy xuất hiện nhưng không được báo trước, trong cảnh mid-credit, vai Eddie Brock / Venom, diễn lại vai diễn của anh từ Vũ trụ Người Nhện của Sony.